Differentiated LUHMES cell 키우기 - 분화편

LUHMES cell을 분화시켜보려고 합니다.

 

Lund human mescencephalic (LUHMES) cell은 human embryonic neuronal percursor cell입니다. 이 셀을 분화시켜서 dopaminergic neuron marker들을 확인하려고 합니다. 일단 결과적으로는 Dopamine transporter와 Tyrosine hydroxylase 인자들을 western blot assay를 통해서 확인했습니다. 또한 CellTiter glo assay를 이용해서 cell viabilty도 검증하였습니다. Celltiter glo assay는 세포 배양 중에 세포에 있는 ATP를 측정하여 세포 viability를 확인할 수 있습니다. 시약 자체 독성도 없고 아주 정확한 결과 측정을 할 수 있는 좋은 assay라고 생각합니다. 그리고 처음 해보는 분화 실험이었는데 좋은 결과를 얻어서 다행이었습니다.

 

Materials	Concentration (i.e. 3 ng/mL)
DMEM:F12 Medium
N2 supplement	100x
Poly-L-ornithine solution	50 μg/ml
Fibronectin human plasma(Human Fibronectin)	1 μg/ml
hBFGF	40ng/ml
GDNF	20ng/ml
L-Ascorbic acid	0.02%
N6,2′-O-Dibutyryladenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt(db-cAMP)	1mM
tetracycline	1ug/ml
6-Hydroxydopamine hydrobromide
CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay
Assay Plate 96 well
L-glutamine	200mM

이렇게 준비했습니다.

 

 

# 실험 전 준비사항

 

코팅!! coating

 

Culture 및 실험 전날에 Dish나 Plate에 Poly-L-Ornithine (50ug/ml)로 처리. (Overnight, Room temperature)

 

그 다음날 모두 Suction 해주고 완전 건조시킵니다!

 

DW로 3번 Washing 해준다. 이후 완전 dry시킴.

 

Human Fibronectin (1ug/ml) 으로 2차 coating을 진행시킨다. (3h, 37℃ or Overnight, 4℃)

 

2차 coating 진행 후 DW로 3번 washing 후 완전 dry시킴.

 

코팅에 들어가는 실험에선 워시와 드라이가 아주 중요해요!

 

 

#분화 differentiation

 

이제 분화를 준비할게요

 

 

DAY -1

 

cell을 dish에 따라 수에 맞게 seeding을 해줍니다.

 

이때 보통 growth media로 cell 안정화시켜줍니다.

 

Growth media : DMEM:f12 500ml(+N2 supplement 5ml, P/S 5ml)

 

 

DAY 0

 

이때부터 분화를 시작합니다. Differntiation media로 Change 해주었습니다.

 

Differentiation Media : DMEM:f12(Tetracycline 1ug/ml, db-cAMP 1nM, GDNF 20ng/ml)

 

 

DAY2

 

그리고 Cell 다시 replating  해주었습니다.

 

Cell이 arrest가 걸린 것을 알 수 있었습니다. 더 이상의 성장은 없었습니다. 

 

 

DAY4 

 

다시 Differentiation media로 half change 해주었습니다.

 

그리고 보통 DAY4~6 일차 때 실험을 들어간다고 합니다.

 

분화!

 

 

여기까지 분화 편이었습니다.

 

잘못됐거나 궁금한 점 있으면 알려주세요~

 

Cell titer glo 관련해서도 글을 올려보도록 하겠습니다!