Primary Hippocampal Neuron Culture(프라이머리 히포캠퍼스 뉴런 컬처) - 2

Primary Hippocampal Neuron Culture 1탄에 이어서 2탄입니다! 실험 시작전 준비사항부터 설명드릴게요. 크게보면 실험준비 - Dissection -Immunochemistry - Confocal imagin - Analysis

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes 논문에서 가져왔습니다

 

 

<실험 전 준비사항>

 

• Coverslips 준비

Autoclave된 Beaker를 dry oven으로 완전히 말린다

 

 

Beaker에 18 mm Coverslip넣고 1 N HCl 약 150mL 넣어준다. 상온에서 rocker speed 100으로 6시간 이상 shaking함.

 

주의사항 : 산성 보호 장갑 착용하고 fume hood에서 진행

 

다음날, 반이상 물을 먼저 채우고 폐수통에 cover slip을 버리지않게 최대한 버림.

 

 

약 200mL의 3’DW로 5번 정도 씻어준다.

 

주의사항 : 벽면이 잘 wash되야함.

 

다되면 100% EtOH에 담가두기.

 

 

• Coverslips 코팅

100% ETOH에 담겨두었던 coverslip을 핀셋으로 화염 멸균시킨 후, culture dish에 4개씩 넣어준다.

 

손상된 coverslip들은 버린다. 1000p tip을 이용해 cover slip간 겹치지 않고 dish와 붙지않게 조절해서 살짝 눌러줌.

 

각 coverslip 위에 50μg/mL PDL을 200μL정도 loading함.

 

퍼지지 않게 조심조심 incubator로 옮기고 37℃ Incubator에서 O/N동안 반응시킴.

 

Cleanbench에서 불을 끄고 PDL을 모두 suction함.

 

3’ D.W 2 mL 정도로 모두 잠기게 wash 함. 30min 간격 3번함.

 

Dissection 과정전에 이 step을 시작해야함.

 

마지막 D.W suction 할때 최대한 suction함.

 

최대한 말려야함.

 

• C57BL/6 (P0) mice , 수술도구, materials 준비함.

 

• Dissection 시작!

준비물: 수술도구, 얼음, HBSS w/phenol-red, culture dish, 장갑, 현미경, 사체봉투 준비

 

P1 mouse 머리(목 위)를 자른다. Forcep으르 눈을 잡아서 고정시키고 skin을 벗겨낸다.

 

가운데 Bregma를 중심으로 skull을 가로질러 조심 살짝 잘라주고 벗겨낸다.

 

Olfactory bulb 쪽으로 넣어서 살짝 들어올려 brain 전체를 들어올려준다.

 

새 dish로 옮겨서 brain을 씻어준다.

 

대뇌 피질을 중뇌, 간뇌, 소뇌에서 분리해준다.

 

Olfactory bulb를 잡아 뜯어내고 위쪽 부터 meninges를 양쪽으로 잡아 찢어준다. Hippocampus쪽에 meninges를 살짝 끊어

 

주고 뒤집어서 전체 meninges를 벗겨준다.

벗겨내면 hippocampus를 찾아서 짤라내어준다. Hippocampus만 새 dish (HBSS)에 옮겨준다.

 

끝을 살짝 자른 1000p tip으로 dissection한 hippocampus들을 새로운 15ml tube로 옮겨준다.

 

Tissue가 모두 가라앉으면 sup을 최대한 따서 Fresh한 상온의 HBSS w/phenol 2mL 을 넣고 살짝 tapping한다. 이 과정을 3번 반복한다.

 

0.25% Trypsin 1mL 넣고 tapping 한다. 37℃, incubator에서 15분동안 반응시킨다. 5분에 한 번씩 tapping한다. - 트립신농도 조금 높음

그 동안 멸균된 pasteur tip을 fire-polishing 시킨다.

 

Tissue가 들어있는 tube를 다시 가져와서 trpysin을 모두 제거한다. 상온에서 보관중인 trituration solution 2mL넣고

Tapping 후 tissue들이 가라 앉으면 sup을 버린다. 3번 반복한다.

 

Trituration solution 1mL넣고 pasteur pipette으로 15번정도 suspension하고 새 15mL tube로 옮겨준다.

 

Cell strainer에 trituration solution 1mL 넣고 거품이 생기지않게 linsing해준다. 새 trituration solution 1mL을 tissue가 들어

있는 15mL tube 벽면에 흘려주면서 최대한 넣는다. Tissue가 들어있는 trituration solution을 strainer에 흘려준다. 3mL 정도

trituration solution을 또 다시 cell strainer 더 흘려준다.

 

Trituration solution + cell  + trypan blue 섞고 cell counting 한다. 

 

60mm dish에 1x10^6로 cell을  seeding 한다.

 

37℃, 6hrs incubation한다. Neurobasal media+ B27 supplement로 media change 후 37℃ incubation 한다.

 

3-4일에 한 번씩 media half change (1.3mL 버리고 1.5mL을 다시 채워준다. 이 날이 DIV0)

 

 

여기까지 dissection 과정입니다.

 

정말 여기서 주의사항으로 cell confluency가 잘 지켜져야해요.

 

카운팅이 그만큼 중요합니다.

 

Confluency가 잘 안맞으면 cell이 안자리기도하고 반대로 너무 많아서 너무 빨리 자라게되서 결과에 큰영향을 미칩니다.

 

여기까지 저의 허접한 dissection 과정 설명이었구 뒤에 이어서 3탄에서 Immunochemistry와 confocal imaging설명드리겠습니다.

 

3탄은 각자 실험목적에 따라 크게 다를것같아서 간단하게 정리하겠습니다!